Журнал «Российская оториноларингология». Дифференциальная диагностика аллергического и инфекционного ринитов: уровень внеклеточных пероксидаз в назальном секрете.


Журнал «Российская оториноларингология» 
№3(10)2004
УДК 616.211-002.193-056.3

Дифференциальная диагностика аллергического и инфекционного ринитов: уровень внеклеточных пероксидаз в назальном секрете. 

М.А. Мокроносова1, Ю.И. Кочетова1, Х.Ш. Давудов2, Г.Д. Тарасова2, Е.В. Смольникова1, В.М. Зайцев2

ГУ Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН, г. Москва (Директор - акад. РАМН Б.Ф. Семёнов)
ГУ Научно-клинический центр оториноларингологии МЗ РФ, г. Москва (Директор - проф. Н.А. Дайхес)

В последнее время в литературе широко дискутируется вопрос о влиянии инфекции на течение персистирующего аллергического ринита.

В проведённом ранее обследовании больных аллергическим ринитом было выявлено, что постоянным представителем микрофлоры в полости носа являются S. aureus и добавочным S. Epidermidis и Corynobacterium spp. [3].

Особое внимание уделяют инфекции, обусловленной S. aureus, что связано со способностью этих микроорганизмов продуцировать суперантигены. Объективно оценить, является ли присутствие S. aureus в назальной полости носительством или фактором персистирующей инфекции, необходимо для назначения адекватной терапии [7].

Хорошо изучена роль нейтрофилов в противоинфекционном иммунном ответе. Важная форма реактивности нейтрофилов – активация кислорода с превращением его в мощный инструмент биоагрессивности. Активация молекулярного кислорода сводится к его частичному восстановлению с образованием частичных радикалов (супераксидный анион, синглетный кислород, гидроксильный радикал) и перекиси водорода. Вместе с миелопероксидазой (МПО) и галогенами они формируют аппарат кислородзависимой биоцидности — важнейшее эффекторное звено фагоцитарных реакций и один из чувствительных индикаторов возбуждения клеток. Интенсивность окислительных процессов имеет прямое отношение к степени цитотоксического эффекта [9].

Таким образом, роль нейтрофилов и продуктов их активации, таких как, например, МПО, до сих пор не изучена. МПО — протеин, высвобождающийся из основных гранул нейтрофилов в процессе их активации. Выявлено достоверное увеличение уровня МПО в сыворотке крови детей с бронхиальной астмой легкой степени, не получавших противовоспалительную терапию, по сравнению с неатопическими пациентами. Предполагается, что нейтрофилы у пациентов с бронхиальной астмой обладают повышенной способностью к активации и высвобождению активных веществ из гранул. И уровень сывороточного МПО резко возрастает при астматическом приступе, вместе с увеличением уровня эозинофильного катионного протеина, что свидетельствует о хроническом воспалении [6].

Очевидно, МПО составляет основной компонент внеклеточных пероксидаз (ПО), обнаруженных в биологических секретах [1]. Кроме МПО в назальном секрете присутствуют эозинофильная пероксидаза и продукты перекисного окисления бактериальных клеток.

Учитывая вышеизложенное, целью исследования явилось определение ПО в назальном секрете больных персистирующим аллергическим ринитом (ПАР), интермиттирующим аллергическим ринитом (ИАР) и инфекционным ринитом (ИР).

Материалы и методы

Пациенты. Были обследованы 163 пациента в возрасте от 1 до 60 лет (средний возраст — 21,9±1,5 года). Все пациенты были разделены на 4 группы. Нозологическая форма была представлена: ПАР, ИАР, ИР и контрольная группа практически здоровых.

Диагноз и степень тяжести заболевания устанавливали на основании:
   - данных анамнеза,  
   - анкетирования [5],  
   - скарификационных кожных проб,  
   - риноцитограммы,  
   - микробиологического анализа назального секрета,  
   - рентгенографии околоносовых пазух носа,  
   - риноскопии, учитывая общепринятые стандарты диагностики [2].  

Забор назального секрета проводили абсорбционным методом [7]. Пинцетом в средний носовой ход каждой половины полости носа помещали по ватному шарику на 15 мин. Пинцетом выжимали волокно в 2,7% растворе динатриевой соли этилендиаминотетрауксусной кислоты (ЭДТА), (pH=7,4), извлекали и прикрепляли к верхней части внутри пробирки. Пробирки центрифугировали при 1000 g в течение 20 мин для осаждения целых эритроцитов, лейкоцитов, слизи и корок. Раствор назального секрета измеряли относительно прибавки к раствору ЭДТА.

Определение внеклеточных пероксидаз в назальном секрете. Концентрацию ПО определяли в разведениях надосадочной жидкости 1:1, 1:10, 1:20. Реакцию ПО в исследуемых образцах проводили при добавлении хромогена тетраметилбензидина (ТМБ) [4]. Инкубацию исследуемых образцов с ТМБ проводили в течение 10 минут при температуре 18-25°С. При появлении в лунках синего цвета оценивали результат цветной реакции на спектрофотометре Stap Fax 2200. Реакцию останавливали добавлением серной кислоты, оптическую плотность раствора измеряли при длине волны 492 нм. В качестве отрицательного контроля использовали 2,7% раствор динатриевой соли ЭДТА. Для построения калибровочной кривой использовали разведения пероксидазы хрена, отработанные опытным путем. Количество ПО определяли с помощью линейного калибровочного графика с учетом объема абсорбированного назального секрета и разведений надосадочной жидкости.

Кожные пробы. Для выявления сенсибилизации к причинным аллергенам было использовано тестирование методом прик-теста с растворами коммерческих аллергенов, содержащие 10 тыс. единиц белкового азота (PNU) в 1 мл. Постановку тестов проводили на сгибательной поверхности предплечья. Учитывали размер волдыря не менее 5 мм спустя 20 минут. В качестве положительного контроля использовали раствор гистамина, в качестве отрицательного — разводящую жидкость.

Риноцитограмма. Назальный секрет собирали из обеих половин носа на предметное стекло. Препарат окрашивали раздельным методом красителями эозином и азуром. Подсчитывали не менее 200 клеточных элементов и определяли процентное содержание нейтрофильных и эозинофильных лейкоцитов, эпителиальных клеток, наличие гранул.

Микробиологическое исследование. Для оценки микрофлоры верхних дыхательных путей проводили бактериологическое исследование мазков со слизистой оболочки полости носа и зева с посевом материала на кровяной, шоколадный агар, среду Сабуро. Засеянные чашки с кровяным и шоколадным агаром инкубировали при температуре 37°С в течение 24 часов в атмосфере с повышенным содержанием CO2 и в анаэробных условиях. Посевы на чашках с плотной средой Сабуро выдерживали при температуре 25°С до 5 суток. После просмотра чашек выделяли чистую культуру микроорганизмов и проводили идентификацию отобранных колоний по общепринятой методике.

Статистическую обработку количественных данных проводили с помощью статистических формул программы Microsoft® Excel 2002 (10.2705.2635) с использованием параметрических и непараметрических статистических величин.

Результаты

Определение ПО в назальном секрете было проведено 163 пациентам с хроническими ринитами. Распределение пациентов по нозологической форме представлено в таблице 1.

таблица1.jpg


Как видно, среди обследованных пациентов преобладали больные с аллергическим ринитом (84/51,5%). Разделение пациентов на группы с ПАР и ИАР использовали для учета острого и хронического аллергического воспаления. То есть, забор назального секрета у больных поллинозом проводили в период весеннего или летнего обострения. У больных ПАР обследование проходило на фоне обычного хронического течения заболевания. Однородность пациентов, распределенных по нозологической форме, равномерное распределение пациентов по полу и возрасту соответствует понятию репрезентативности, что в последующем позволило сравнивать эти группы.

Аллергический ринит (и персистирующий, интермиттирующий) оценивали по степени тяжести в баллах. (Табл. 2).

таблица2.jpg


Очевидно, что у пациентов ИАР заболевание протекало значительно легче, и в 61,4% случаев зафиксировано как легкое, против 17,5% - у пациентов с ПАР. В связи с этим, последующее исследование уровня ПО в назальном секрете проводили в зависимости от степени тяжести течения общего числа больных, страдающих ПАР и ИАР.

При кожном тестировании было показано, что пациенты с ПАР в 77,5% случаев были сенсибилизированы преимущественно к клещам домашней пыли, а у 37,5% больных выявлена сенсибилизация к эпидермальным аллергенам. Для пациентов с поллинозом была характерна гиперчувствительность к пыльце березы (56,8%) и злаковых трав (31,8%).
Результаты риноцитограммы характеризовались наличием эозинофилии у больных аллергическим ринитом, и нейтрофилии у пациентов с ИР. Для оценки клеточного состава назального секрета использовали коэффициент соотношения процентного содержания эозинофилов к процентному содержанию нейтрофилов. Для аллергического воспаления полости носа этот коэффициент превышал 0,1. Для больных ИР была не характерна эозинофильная инфильтрация (коэффициент=0).

52 пациента с синуситами были обследованы в фазе острого инфекционного воспаления. Все они жаловались на гнойное отделяемое из полости носа. У большинства пациентов диагноз синусит был подтвержден рентгенологически.

Микробиологичнское исследование мазка из назальной полости выявило обильный рост S.aureus у 73,8%, C.pseudodiphtericum — у 34,5% и S.epidermidis у 33,3% больных аллергическим ринитом. У больных синуситами инфекция была обусловлена S.aureus (51,9%), S.pneumoniae (48,1%), C.pseudotuberculosis (32,7%), Pseudomonas aeroginosa (11,5%).
Сравнительный анализ уровня ПО у пациентов с различными нозологическими формами представлен на рисунке 1.

рис1.jpg

Очевидно, что средние значения ПО во всех обследованных группах достоверно выше, чем у здоровых доноров (p<0,01). У больных ПАР и ИАР значения ПО (3,29±0,73 мкг/мл и 3,34±0,75 мкг/мл, соответственно) достоверно различались с таковыми при ИР (2,09±0,44 мкг/мл; p<0,05). Полученные данные позволили нам определить границу нормы и патологии при определении уровня ПО в назальном секрете у больных ПАР, ИАР и ИР, которая составила 0,69±0,14 мкг/мл.

Далее оценивали зависимость уровня ПО назального секрета от степени тяжести течения аллергического ринита (Рис. 2).

рис2.jpg

Как видно, у пациентов с тяжелым течением АР уровень ПО превышает эти значения у больных с легким и среднетяжелым в 2 раза (p<0,01). Это очевидное свидетельство высокой перекисной активности не только миелопероксидазы нейтрофилов, но и эозинофильной пероксидазы и бактериальных ферментов.


Распределение значений уровня ПО в зависимости от возраста не выявило никаких закономерностей ни для больных ИР, ни для пациентов с аллергическим ринитом. Во всех возрастных группах получали как низкие, так и высокие значения ПО (r=-0,24). Аналогично не было найдено зависимости уровня ПО от клеточного состава назального секрета (r=-0,08).
Полученные данные позволяют использовать значения уровня ПО в качестве одного из объективных критериев для дифференциальной диагностики аллергического и инфекционного ринитов (Табл. 3).

таблица3.jpg

Обсуждение 

Для ПАР характерно хроническое воспаление слизистой оболочки полости носа, которое отличают черты и аллергического, и инфекционного процесса. Особенности острого аллергического воспаления можно наблюдать у больных поллинозом, когда за короткий промежуток времени развивается отечность и ринорея. На фоне гиперчувствительности слизистых оболочек происходит нарушение мукозального иммунитета, что влечет присоединение персистирующей инфекции. При инфекционном рините генез воспаления принципиально отличается. Хронические рецидивирующие синуситы протекают чаще всего на фоне первичного снижения параметров локального иммунитета.

МПО — протеин, высвобождающийся из гранул активированных нейтрофилов, появляется при любом инфекционном стимуле. Проведенное исследование отражает характерный для ринита любой природы факт: уровень ПО (включая МПО) повышается более чем в 2 раза, по сравнению с таковым у здоровых доноров.

Сравнительный анализ уровня ПО в назальном секрете у больных ПАР и ИР показал достоверные различия. У большинства пациентов с ПАР был выявлен обильный рост S.aureus. Является ли продукция МПО реакцией на антигены S.aureus, какова доля ПО бактериальных клеток, вопросы дискутабельные.

Для назначения адекватной терапии ринитов необходима диагностика с определением маркеров, характеризующих качество воспаления. Проведенное исследование позволяет предложить определение уровня ПО в назальном секрете в качестве объективного критерия воспаления при ринитах.

ЛИТЕРАТУРА

  1. Азнабаева Л.Ф. Провоспалительные цитокины в иммунопатогенезе и лечении хронических гнойных риносинуситов: Автореф. дисс. ...докт. мед. наук / Л.Ф.Азнабаева. - Спб, 2002.- 24 с.
  2. Диагностика и лечение аллергического ринита, и его влияние на астму. Руководство для врачей. Материалы отчета ARIA EAACI в сотрудничестве с ВОЗ. -М., 2001.- 24 с.
  3. Особенности микрофлоры слизистых оболочек верхних дыхательных путей при аллергическом рините / М.А. Мокроносова, Э.Е. Романенко, А.П. Батуро и др. // Росс. Оторинолар. - 2003. - №5(2). - С. 134-138.
  4. Фримель Г. Иммунологические методы / Г. Фримель. - М.: Медицина, 1987. - 472 с.
  5. Annesi-Maesano I. The Score for Allergic Rhinitis (SFRA): a simple and valid assessment method in population studies / I.Annesi-Maesano, A.Didier, M.Klossek // Allergy. - 2002. - Vol.57. - P.107-114
  6. Assessment of serum myeloperoxidase in children with bronchial asthma / E. Tauber, Y.Herouy, M.Goetz et al. //Allergy. - 1999. -Vol.54. - P.177-182
  7. Bachert C. Staphylococcus aureus enterotoxins: a key in airway disease? / C. Bachert, P. Gevaert, P. van Cauwenberg // Allergy. - 2002. - Vol.57. - P. 480-487
  8. Klimek L. Norm values for eosinophil cationic protein in nasal secretions: influence of specimen collection / L. Klimek, G. Rasp // Clin. Exp. Allergy. - 1999. - Vol.29. - P. 367-374.
  9. Linden A. Neutrophilic airway inflammation and IL-17 / A. Linden, M. Adachi // Allergy. - 2002. - Vol.57. - P. 769-775


ЛОР БОЛЕЗНИ АКТУАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ЦЕНЫ АКЦИИ КОНТАКТЫ
115054, Россия, Москва, 5-й Монетчиковский переулок, 14.
+7 (495) 642-45-25
+7 (926) 384-40-04
doctor-zaytsev@yandex.ru
Использование материалов сайта
Карта сайта
Copyright © Врач оториноларинголог Владимир Михайлович Зайцев 2017
Мы принимаем к оплате пластиковые карты


Яндекс.Метрика